tarea 2, tercer parcial

CBTIS NO. 155

OPERAR EQUIPO Y MATERIALES DE LABORATORIO

DR. VICTOR MANUEL ALFARO LOPEZ

2LV(M)

TAREA 2, 3 PARCIAL, MEDIOS DE CULTIVO

GRANADOS JAIME LUZ MARIA

MEDIOS DE CULTIVO

Uno de los sistemas más importantes para la identificación de microorganismos es observar su crecimiento en sustancias alimenticias artificiales preparadas en el laboratorio.

El material alimenticio en el que crecen los microorganismos es el medio de cultivo y el crecimiento de los microorganismos es el cultivo.

Para que las bacterias crezcan adecuadamente en un medio de cultivo artificial debe reunir una serie de condiciones como son: temperatura, grados de humedad y presión de oxigeno adecuado, así como un grado correcto de acidez o alcalinidad.

El agar es un elemento solidificante muy empleado para la preparación de medios de cultivo. Se licua completamente ala temperatura del agua hirviendo y se solidifica al enfriarse a 40 grados. Con mínimas excepciones no tiene efecto sobre el crecimiento de las bacterias y no es atacado por aquellas que crecen en el.

Clasificación de los medios de cultivo basándose en su composición química.

Medios sinteticos o químicamente definidos. Llevan fuente de carbono, fuente d enitrogeno, sales que suplan iones (P, K, Mg, Fe, Ca, ) otros elementos como son estimuladores del crecimiento ( eritritol para Brucella abortus) pero siempre a concentraciones conocidas.

Medios complejos o de composición idenfinida. Estos medios llevan ingredientes como extracto de levadura, peptona, infusión de cerebro, extracto de carne, etc. Que contiene nutrientes en abundancia pero sin saber con exactitud la composición cualitativa ni cuantitativa de estos nutrientes.

Medios de enriquecimiento. Son medios complejos (normalmente) con adictivos adicionales para favorecer el crecimiento de determinados organismos (particularmente heterótrofos exigentes).

Medios selectivos. Son aquellos que favorecen por su diseño el crecimiento específico de un microorganismo particular (o grupo de microorganismos). Es de gran utilidad para el aislamiento de microorganismos a partir de una población microbiana mixta.

Medios diferenciales. Son aquellos destinados a facilitar la discriminación de microorganismos de una mezcla por sus propiedades diferenciales de crecimiento en dicho medio.

Medios de mantenimiento. Suelen ser distintos a los de crecimiento optimo ya que el crecimiento rápido y prolífico suele ocasionar la muerte rápida de las células.

SIEMBRA

Sembrar o inocular es introducir artificialmente una porción de muestra (inóculo) en un medio adecuado, con el fin de iniciar un cultivo microbiano. Luego de sembrado, el medio de cultivo se incuba a una temperatura adecuada para el crecimiento.
La siembra puede realizarse en medio líquido, sólido o semisólido, utilizando punta, ansa, hisopo o pipeta estéril.

Cultivo en medio líquido

Habitualmente se realiza en tubos o en matraces. El crecimiento se puede manifestar por enturbiamiento, por formación de velo o película, o por sedimento.

Cultivo en medio sólido

Puede ser en tubos o placas.

a) Tubos con agar inclinado. Para sembrarlos, se mueve el ansa o la punta suavemente sobre la superficie del agar con un movimiento en zigzag desde el fondo hasta la parte superior, cuidando de no dañar el agar.

b) Tubos sin inclinar. Se siembran introduciendo una punta en el centro del agar. También se llama siembra por picadura.

c) Siembra en placas. Puede ser en superficie o incorporada.

En superficie

• 1) Se colocan 0.1 mL de la dilución de la muestra con pipeta estéril en el centro de la placa, y se distribuye con un rastrillo estéril.
  2) Se siembra con un ansa para aislar, como se explica más adelante.
  3) Se siembra con un hisopo.

Incorporada

• Se coloca 1 mL de la muestra en una placa estéril vacía, en el centro de la misma. Sobre ella se agregan 20 mL de medio de cultivo fundido y termostatizado a 45ºC; luego se agita la placa, moviéndola 4 veces en sentido horario, 4 en sentido antihorario, una vez de arriba a abajo, una vez hacia los costados y una vez en sentido antihorario.

Las placas se incuban invertidas, ya que la alta concentración de agua en el medio puede provocar condensación durante la incubación y si cae sobre la superficie del agar, se extiende dando un crecimiento confluente.

En medio sólido cada célula viable dará origen a una colonia y por lo tanto la siembra en placas se puede utilizar, no solo para cultivar microorganismos, sino además para contar y aislar.

En general cuando se quieren tener colonias aisladas a partir de un material determinado, es necesario diluir la muestra en tubos con suero fisiológico estéril.

AISLAMIENTO

Aislar: Es separar un tipo de microorganismo a partir de un población que los contiene de varios tipos. En habitats naturales, raramente encontramos a los microorganismos en cultivo puro (un solo tipo de microorganismo), por lo tanto es necesario hacer algún procedimiento de aislamiento para separar e identificar los distintos tipos de m.o. presentes.

El aislamiento se puede lograr directamente a partir de una muestra cuando el o los m.o. están en una proporción adecuada.

Cuando el m.o. que se desea aislar e identificar se encuentra en baja proporción en la muestra, o interesa un solo tipo de m.o., se lleva a cabo un procedimiento llamado búsqueda que involucra una primera etapa de aumento del número de microorganismos del tipo que se desea aislar en relación al resto de la población. Luego se aisla por el método de estrías o por dilución y se identifica.

Para aislar se utiliza alguno de los siguientes procedimientos:

a) aislamiento por estrías
b) aislamiento por dilución

Aislamiento en placa por estrías

Existen distintas técnicas, el objeto es obtener colonias aisladas.

Técnica a.

Consiste en cargar el ansa con la muestra y hacer estrías paralelas en la cuarta parte de la superficie de la placa; se quema el ansa, se enfría, se gira la placa 90º y se vuelve a estriar tocando 3 o 4 veces el área sembrada inicialmente y cubriendo otro cuarto de placa. Por último, sin quemar el ansa, se estría el resto de la superficie sin sembrar.

Técnica b

Con el ansa cargada se hacen 3 o 4 estrías; se quema el ansa, se hacen 3 o 4 estrías perpendiculares a las anteriores, se quema el ansa y se repite el procedimiento hasta agotar la superficie de la placa.

Aislamiento por dilución en medio sólido

Se emplean tanto el método de siembra incorporada como el de siembra en superficie. Suele ser necesario diluir la muestra. Para ello se puede preparar las diluciones decimales en condiciones asépticas usando suero fisiológico o algún otro diluyente.

La siembra incorporada se realiza tal como se describió anteriormente. También se pueden preparar las diluciones directamente en tubos de agar fundido y termostatizado (20 mL) se agita por rotación entre las manos y se vierte en placas de Petri estériles.

AISLAMIENTO DE MICROORGANISMOS ANAEROBIOS

Para aislar microorganismos anaerobios que son rápidamente destruidos por exposición al oxígeno, las placas pueden ser preparadas en la forma usual, y luego de sembradas, incubadas en recipientes cerrados en atmósfera sin oxígeno.

También se puede sembrar diluciones en tubos con agar fundido y termostatizado que luego se tapan con una capa de vaselina-parafina, para evitar el acceso de aire.

Con anaerobios más sensibles al oxígeno, se trabaja en cámaras anaerobicas, o también usando la técnica del "roll-tube", que es un tubo en el que el agar se deposita en las paredes al hacerlo girar mientras se enfría; se trabaja gaseando el tubo continuamente con gas libre de O2 mientras el tubo está destapado.